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四．讨 论
体外器官型植块培养，对于检测控制疾病和健康过程的多种因子有特别的实验价值，因为在此培养环境中, 原来在体内胃肠道环境中的各种各样的刺激物、体液因子、植物神经等影响因素皆可一一避免。但由于植块中上皮细胞之间的联系、上皮细胞与间充质之间的联系以及结缔组织支持框架没有发生任何改变，因此，此时观察激素、药物、血源性因子以及神经递质等因素对粘膜代谢和分泌的直接影响，非常直观明了，并且能够允许实验者直接用来自活体动物的肠粘膜组织进行培养，以观察粘膜的生理再生、分泌和上皮代谢等重要生理指标。我们采用体外培养法就是为了能够更直观地观察到GIC对细胞生长的直接影响，从细胞水平探讨GIC作用的机理。
Yeomans于1976年报道了一种胃组织的体外培养方法 ，他用的是18天龄大白鼠的胚胎胃，快速取胃，刀切均分为三段，近端1/3弃去，
中间1/3为胃底部，远端1/3为胃窦部，胃窦部及胃底部全层切成极小的碎片（<2mm）。这些植块粘膜面向上，贴在塑料培养板的底部，水平摇床37 培养3天，设定摇速，平均约每分钟使培养液冲洗植块2次，这是第一种方法。另一种方法是将粘膜放在金属网格上，然后把粘膜连同网格一起置于多孔培养板中央的孔，其它孔中置入无菌生理盐水浸泡过的无菌纱布以便保持湿度，盖好，置入一个密闭容器中，通95%的氧气和5%的CO2，37培养箱中培养。由于上述体外培养方法目前还没有适宜的培养基，实验者维持体外培养的胃粘膜组织存活时间普遍较短，一般很难超过48小时，培养基中如果不加血清，时间更短，6~12小时会退化坏死，尽管他们很注意选用好的培养基（9份DMEM-HEPES加1份NCTC-135，另加10%胎牛血清），但由于植块存活时间短，给实验者提供的检测时间有限，检测项目不能设计的太多，太多了做不完，时简比较仓促，观察结果只能观察那些即刻的实验结果，而不能观察较长时间（或延迟的）才出现的实验结果。由于上述方法不能为长时间培养提供稳定的培养条件，用这种方法进行体外培养人胃肠道的粘膜，形态完整性和功能稳定性仅能维持6~12个小时，家兔胃粘膜活性组织最多可有24小时的稳定生理功能，之后就会出现不可逆渐进性退化直至死亡。
含有GIC的培养基直接打破了现有培养条件的限制，可以长期培养离体胃粘膜组织，便于在光镜下直接观察GIC对胃粘膜生长的中长期影响，给粘膜体外培养带来了一次根本性改变，这在传统培养基和传统方法下是不可能实现的。由于使用了含有GIC培养基，作者实现了本实验的目的，本实验的主要目的就是观察GIC对粘膜生长的影响，此结果也充分体现了GIC对胃粘膜组织的细胞保护作用。
为什么胃粘膜能够在这种环境中长期生长呢？可能有两个原因：一是GIC本身就是具有丰富而全面营养的细胞培养基和良好的细胞保护剂；另一个是胃粘膜组织中有粘膜干细胞，GIC激活了干细胞，促进了干细胞增殖。
对于第一个原因的解释：
GIC有效成分中含有的亚油酸是细胞必需的脂肪酸，是构成细胞生物膜不可缺少的组分，是皮肤、粘膜及深层组织损伤后进行修复的重要材料。另外GIC有效成分中还含有蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸等多种氨基酸以及多种脂类物质、维生素、微量元素，为胃粘膜细胞生长提供了丰富的营养。有效成分具有抗病原微生物作用，对多种细菌、病毒、真菌、原生物都有较强的抑制作用，同时具有抗炎作用。GIC中的有效成分还可以促进细胞的能量代谢、蛋白质及核酸合成和生物膜的转运等功能。GIC中的缓释剂成分使其缓慢释放至培养基，防止浓度过高或过低，使细胞持续得到恒定的营养 。
GIC有效成分中的抗氧化作用对长期培养的细胞的存活极为重要，抗氧化表现为抗自由基、稳定细胞膜。自由基是广泛存在于各种化学反应中的活泼基团，倘若其产生过量，从而引发所谓的自由基链式反应，则将导致细胞膜多不饱和脂肪酸的脂质过氧化，所产生的大量脂质过氧化物会损伤细胞膜及细胞内的大分子蛋白质与核酸，对细胞造成损伤。GIC有效成分中含有大量的维生素E，维生素E的抗自由基功能是由于其自身结构具有还原性，进而捕捉自由基从而阻断自由基链式反应，起到对细胞的保护作用，而其自身则经过维生素C和含硫氨基酸的再生而还原或转变为醌类化合物。大量维生素E的存在可使细胞处于流动性高、通透性严密的状态。这除了可保护膜上大量的多不饱和脂肪酸不被氧化外，还与其可以保护膜蛋白的活性结构有关。
对于第二个原因的解释：
胃粘膜组织中有粘膜上皮干细胞，GIC启动了干细胞。胃粘膜的上皮组织来源于上皮干细胞（epithelial stem cell）,
用 -胸腺嘧啶脱氧核苷放射自显影研究显示，胃粘膜的上皮干细胞位于胃小凹底部至胃底腺颈部的细胞群中 。组织学显示胃小凹底部的表面粘液细胞与胃上皮其它部位的同种细胞相比，体积稍小，粘原颗粒较少，分化程度较低，具有旺盛的增殖能力。那些丧失分裂能力的子细胞向小凹上部与粘膜表面不断移动，最终这些细胞变为成熟的饱含粘原颗粒的表面粘液细胞。细胞到达粘膜表面后不久即脱落。新生的细胞从小凹底部开始向上迁移至脱落需要3~4天的时间。这些胃粘膜的干细胞最容易在体外增殖，干细胞属于未分化细胞，尽管脱离了体内生长的微环境，但仍然具有较强的增殖能力。
至于生长的细胞的性质，我们认为就是胃粘膜细胞，主要原因有两个：一是因为粘膜上皮干细胞在体外有较强的增殖功能，在体外可有一定程度的生长繁殖，这已经为许多研究结果所证实，胃壁其它细胞均不具备这种能力，本实验所用的胃组织标本中，除粘膜细胞外，数量最多的应该是胃壁的平滑肌细胞，平滑肌细胞在体外只能进行有限的增殖，本实验完全可以排除平滑肌细胞生长的可能性，因为培养自始至终未曾发现形态呈条形或梭形、排列呈束状的平滑肌细胞生长。再次，目前还没有发现平滑肌干细胞，这也被认为是平滑肌在体外不易长期生长的原因之一。其它细胞如粘膜下层疏松结缔组织中的动脉、静脉、淋巴管、神经纤维和粘膜下神经丛等组织的细胞能如此生长的可能性很小；第二个原因是优势生长的问题，当某种细胞特别容易生长的时候，其它细胞的生长就会受到一定程度的抑制或者完全被抑制，本实验中其它细胞的生长完全可以被胃粘膜细胞旺盛的生长所抑制。
参 考 文 献
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